研究團(tuán)隊(duì)首先合成了DOX-TPP@ZIF-67 NPs。首先，將硝酸鈷和2-甲基咪唑在水中反應(yīng)，形成紫色的ZIF-67納米顆粒。然后將帶有三苯基膦（TPP）的DOX溶于水中，加入到ZIF-67中，利用其孔結(jié)構(gòu)和表面電荷吸附藥物，在pH約6.5–7的條件下反應(yīng)72小時(shí)，獲得中空結(jié)構(gòu)的DOX-TPP@ZIF-67 NPs。TEM和SEM圖像顯示顆粒約為210 nm；N?吸附-脫附測試顯示具有介孔結(jié)構(gòu)，表明藥物已裝載；裝藥后比表面積與孔體積略有降低，驗(yàn)證了載藥效果；BJH分析顯示孔徑集中在約2 nm和60 nm。ZIF-67的鈷離子中心具有催化分解H?O?的功能，可使納米粒子在富含H?O?的環(huán)境中實(shí)現(xiàn)推進(jìn)；在不同濃度H?O?中觀察到粒子運(yùn)動(dòng)軌跡增強(qiáng)、擴(kuò)散速率增快、均方位移（MSD）升高；表明其可作為“納米馬達(dá)"，在腫瘤等富H?O?微環(huán)境中增強(qiáng)藥物富集。藥物釋放在酸性環(huán)境（pH 5.5）和高H?O?濃度下顯著加快；表明其具有pH和H?O?響應(yīng)性，適合于腫瘤微環(huán)境中的靶向藥物釋放 （圖1）。

圖1. 表征，藥物裝載，和空心DOX-TPP@ZIF-67 NPs和NPs運(yùn)動(dòng)的藥物釋放譜。(A)中空DOX-TPP@ZIF-67 NPs的制備流程圖。(B) ZIF-67 NPs和空心DOX-TPP@ZIF-67 NPs的透射電鏡（TEM）和（C?D）掃描電鏡（SEM）圖像。三張單獨(dú)的TEM圖像被包括在內(nèi)，以呈現(xiàn)不同的視角和不同程度的結(jié)構(gòu)破壞(D)。(E) ZIF-67 NPs和空心DOXTPP@ZIF-67 NPs的BET分析。(F)在不同H2O2濃度的PBS溶液中，ZIF-67@DOX-TPP NPs在2 s內(nèi)的代表性軌跡。(G)速度測量以mean±SEM表示，n = 15。(H)中空DOX-TPP@ZIF-67 NPs的均方位移（MSD）分析。（I?J）不同pH條件(I)和不同H2O2濃度(J)下NPs中DOX-TPP的累積釋放量(n = 3；平均值±SEM)。所有柱狀圖表示均數(shù)±SEM， n = 3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，采用單因素方差分析和Tukey多重比較檢驗(yàn)來評估組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。P值如圖所示。

該微針陣列是利用摩方精密microArch^® S240 （精度：10 μm）3D打印設(shè)備加工模具后經(jīng)PDMS翻模制備而成的。首先將藥物負(fù)載的納米顆粒（DOX-TPP@ZIF-67 NPs）與PVA/蔗糖基質(zhì)混合，涂覆到PDMS模具中以形成可溶性微針；然后通過第二次澆鑄聚苯乙烯（PS）形成微針背板層。微針陣列為10×10排列，每根針的高度為850 μm，針底直徑為400 μm，針間距為700 μm；PVA/蔗糖用于制針頭，因其良好的機(jī)械性和水溶性；PS用于背板，增強(qiáng)化學(xué)穩(wěn)定性并降低成本；元素分布圖顯示微針中C、O、Co分布均勻，掃描區(qū)域中P含量為0.33%，證明藥物負(fù)載成功。力學(xué)測試顯示每根微針可承受最高0.62 N壓力，足以穿透皮膚。在豬皮膚外植體測試中，微針可在表皮留下均勻孔洞，表現(xiàn)出良好的穿透性能；冷凍切片分析顯示藥物能夠有效穿透皮膚層；OCT成像證實(shí)微針可穿透皮膚至少300 μm深度，進(jìn)一步驗(yàn)證其優(yōu)異的透皮遞送能力。所構(gòu)建的HDT-Z@MNs結(jié)構(gòu)合理、力學(xué)性能良好，藥物成功集中裝載于針尖，在豬皮模型中表現(xiàn)出優(yōu)異的穿透力和藥物輸送效率，為腫瘤局部治療提供了可靠的經(jīng)皮給藥平臺(tái)（圖2）。

圖2. 中空DOX-TPP@ZIF-67納米顆粒負(fù)載納米顆粒的表征（HDT-Z@MNs）。(A) HDT-Z@MNs制備模式圖。(B) HDT-Z@MNs的代表性光學(xué)顯微鏡圖像。(C)掃描電鏡圖像的HDT-Z@MNs陣列與一個(gè)單一的MN在最右邊。（D-E）單個(gè)MN的SEM截面圖，(D) MN尖部截面積中C、O、Co的元素分布，以及尖部截面積的EDS點(diǎn)分析圖(E)。(F) HDT-Z@MNs的力-位移曲線。（G-H） HDT-Z@MNs穿刺離體豬皮的代表性明場顯微鏡圖像(G)和光學(xué)相關(guān)斷層掃描結(jié)構(gòu)圖像(H)。

藥物載體通過能量依賴性胞吞被細(xì)胞內(nèi)吞，首先定位于內(nèi)體，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體釋放藥物，藥物最終進(jìn)入胞質(zhì)并向線粒體靶向遞送；TEM圖像確認(rèn)納米粒子被細(xì)胞攝取，并定位于溶酶體中；TPP?是一種疏水陽離子，易在線粒體負(fù)膜電位驅(qū)動(dòng)下富集在線粒體；在MCF-7/DOX細(xì)胞中共孵育2、4、8、12小時(shí)，觀察DOX與線粒體共定位；共定位率隨時(shí)間增加，12小時(shí)時(shí)HDT-Z@MNs組最高（0.71），明顯優(yōu)于：D@MNs（自由DOX@MNs）；DT@MNs（DOX-TPP@MNs）；HD-Z@MNs（中空DOX@ZIF-67 MNs）優(yōu)勢歸因于：ZIF-67提供的載體結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)能力；TPP?賦予的線粒體靶向特性。HDT-Z@MNs通過納米馬達(dá)運(yùn)動(dòng)性與TPP?介導(dǎo)的線粒體靶向雙重機(jī)制，實(shí)現(xiàn)高效胞內(nèi)遞送與線粒體定位，尤其在DOX耐藥乳腺癌細(xì)胞中顯示出增強(qiáng)的細(xì)胞攝取與線粒體富集能力，為耐藥性乳腺癌治療提供了新的策略和突破點(diǎn)（圖3）。

圖3. 中空DOX-TPP@ZIF-67的細(xì)胞內(nèi)攝取和線粒體靶向。(A)腫瘤細(xì)胞內(nèi)NPs運(yùn)動(dòng)示意圖。（B-C）經(jīng)HDT-Z@MNs處理2、4、8和12小時(shí)的MCF-7/DOX細(xì)胞。細(xì)胞核和線粒體分別用Hoechst 33342（藍(lán)色）和Mtio-Tracker Green染料染色，共聚焦顯微鏡觀察線粒體和NPs共定位圖像(B), (C)柱狀圖中顯示的共定位比代表使用ImageJ中的Coloc2插件計(jì)算的Manders '重疊系數(shù)（MOC）。(D)對經(jīng)HDT-Z@MNs處理12 h的MCF-7/DOX細(xì)胞進(jìn)行超薄切片，透射電鏡觀察細(xì)胞對DOX/DOX-TPP的攝取過程。(E)分別在MCF-7/DOX細(xì)胞中孵育12 h后，D@MNs、DT@MNs、HD-Z@MNs和HDT-Z@MNs與線粒體共定位的熒光圖像。細(xì)胞核用Hoechst 33342染色（藍(lán)色），線粒體用Mito-Tracker Green FM標(biāo)記（綠色）。紅色熒光表示DOX或DOX-TPP。右邊的白色熒光表示與線粒體共定位的部分，最右邊的列表示MCF-7/DOX細(xì)胞質(zhì)溶膠中計(jì)算出的線粒體和DOX共定位的比例。共定位比用Manders系數(shù)表示，使用ImageJ中的Coloc2插件計(jì)算。所有柱狀圖表示均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n = 3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，采用單因素方差分析后采用Tukey多重比較檢驗(yàn)來評估組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。P值如圖所示。

細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)顯示：在2、4、8 μg/mL濃度下，HDT-Z@MNs對MCF-7/DOX細(xì)胞具有強(qiáng)毒性，IC50為4 μg/mL，優(yōu)于其他對照組；克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，HDT-Z@MNs處理后，MCF-7/DOX細(xì)胞的克隆顯著減少，且結(jié)構(gòu)松散；Live/dead染色顯示HDT-Z@MNs對細(xì)胞均具明顯毒性。劃痕實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞遷移：HDT-Z@MNs處理后，MCF-7/DOX細(xì)胞的傷口閉合率僅20.1%；在含Matrigel的模型中，HDT-Z@MNs組細(xì)胞侵襲能力低；表明該系統(tǒng)顯著抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。HDT-Z@MNs通過線粒體靶向遞藥，有效增強(qiáng)阿霉素敏感與耐藥乳腺癌細(xì)胞的線粒體損傷與凋亡，顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。這為抗癌與抗轉(zhuǎn)移治療提供了一種高效且精準(zhǔn)的化療策略，尤其在耐藥性乳腺癌治療中展現(xiàn)出突破性潛力（圖4）。

圖4. HDT-Z@MNs對癌細(xì)胞死亡和抑制轉(zhuǎn)移的體外評價(jià)。(A) MCF-7/DOX細(xì)胞與HDT-Z@MNs等孵育48小時(shí)后的細(xì)胞活力。(B)平板克隆實(shí)驗(yàn)中MCF-7/DOX細(xì)胞經(jīng)HDT-Z@MNs等處理后形成的細(xì)胞簇圖像和(C)細(xì)胞簇率。(D)不同處理后MCF-7/DOX細(xì)胞的活/死染色。DOX濃度在所有組中一致。綠色熒光（Calcein-AM）表示活細(xì)胞，紅色熒光（碘化丙啶，PI）表示死細(xì)胞，(E)表示細(xì)胞存活率。光學(xué)圖像顯示體外傷口愈合試驗(yàn)和(F)相應(yīng)的傷口愈合百分比。MCF-7/DOX細(xì)胞貼壁后（0 h）通過繪制均勻的細(xì)胞間隙建立傷口(G)。HDT-Z@MNs等與細(xì)胞共孵育24小時(shí)后檢測傷口愈合百分比(E)。(h)不同MN貼片處理后MCF-7/DOX細(xì)胞穿過Matrigel屏障的代表性圖像，以及(I)所示侵襲率的量化。所有柱狀圖表示均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n = 3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，采用單因素方差分析后采用Tukey多重比較檢驗(yàn)來評估組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。P值如圖所示。

全程小鼠體重穩(wěn)定，提示整體治療方案安全性良好?？鼓[瘤療效顯著（MCF-7/DOX 和 MCF-7模型）：MCF-7/DOX小鼠模型中，HDT-Z@MNs組腫瘤抑制明顯，治療21天后腫瘤體積為初始的1倍以內(nèi)，優(yōu)于DT@MNs與HD-Z@MNs；腫瘤重量最小，且組織成像顯示藥物精確遞送至腫瘤組織內(nèi)部至少100 μm；生存期延長顯著：60%小鼠生存超48天，而對照組31天內(nèi)全部死亡；誘導(dǎo)凋亡， HDT-Z@MNs誘導(dǎo)細(xì)胞壞死/凋亡，并抑制增殖； HDT-Z@MNs能提高上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)，降低N-cadherin和Vimentin表達(dá)，提示其有效抑制EMT過程，具有抗轉(zhuǎn)移潛力。組織病理學(xué)分析表明主要器官未見明顯損傷，表明全身毒性可控（圖5）。HDT-Z@MNs在阿霉素敏感與耐藥性乳腺癌模型中表現(xiàn)出顯著的腫瘤抑制、延長生存、抑制轉(zhuǎn)移及良好的安全性，為耐藥性腫瘤提供了一種有前景的線粒體靶向化療策略。后續(xù)研究應(yīng)著重于多次給藥、聯(lián)合治療策略以及與傳統(tǒng)給藥方式的系統(tǒng)比較。

圖5. 在皮下耐藥乳腺癌模型中評估HDT-Z@MNs的體內(nèi)抗腫瘤功效。(A)皮下接種MCF-7/DOX腫瘤小鼠模型示意圖及后續(xù)治療方案。局部腫瘤以對照、Z@MNs、DT@MNs、HD-Z@MNs或HDT-Z@MNs的方式給予，小鼠在治療期間的體重變化(B)、生存周期(C)和腫瘤生長動(dòng)力學(xué)(D)進(jìn)行治療(n = 5；平均值±SEM)。采用log-rank檢驗(yàn)評估組間生存周期有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(F) HDT-Z@MNs穿刺腫瘤部位后的冰凍切片圖像，右側(cè)為腫瘤部位藥物釋放的放大和熒光。HDT-Z@MNs和其他對照小鼠治療過程中腫瘤生長變化圖像(G)、治療結(jié)束時(shí)切除腫瘤圖像(H)和(E)切除腫瘤重量(n = 5；平均值±SEM)。(I) HDT-Z@MNs及其他對照小鼠治療結(jié)束時(shí)切除腫瘤組織末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧尿苷缺口末端標(biāo)記（TUNEL）、Ki67和H&E染色的代表性圖像。（D和E）采用單因素方差分析，并采用Tukey多重比較檢驗(yàn)來評估組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。P值如圖所示。

對MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞（未處理及HDT-Z@MNs處理）進(jìn)行定量能量代謝分析與廣泛靶向脂質(zhì)代謝組學(xué)分析；主成分分析（PCA）顯示四組代謝輪廓顯著分離，共鑒定出692種代謝物差異；PC、PE、PS和TG是主要的脂質(zhì)亞類成分；代謝通路富集分析表明HDT-Z@MNs可激活與細(xì)胞死亡密切相關(guān)的脂質(zhì)代謝通路；能量代謝分析揭示其誘導(dǎo)碳代謝、核苷酸代謝、TCA循環(huán)等關(guān)鍵通路的重構(gòu)。磷酸乙醇胺積累導(dǎo)致線粒體膜完整性破壞：磷酸乙醇胺是合成PE的重要中間體，其水平升高可影響線粒體膜脂組成，破壞外膜結(jié)構(gòu)，從而觸發(fā)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；在TPP修飾的線粒體靶向藥物DOX-TPP存在下，這種損傷進(jìn)一步加劇。HDT-Z@MNs處理后，Bax（促凋亡）上調(diào)、Bcl-2（抗凋亡）下調(diào)，導(dǎo)致線粒體外膜通透性增加；隨后細(xì)胞色素c釋放，誘導(dǎo)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-3裂解；同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)顯示HDT-Z@MNs誘導(dǎo)的晚期凋亡水平是其他對照組的1.5~4倍（圖6）。HDT-Z@MNs通過精準(zhǔn)遞送DOX-TPP至線粒體，結(jié)合脂質(zhì)代謝異常與能量通路重編程，高效誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的凋亡，為解決耐藥性乳腺癌提供了靶向性強(qiáng)、機(jī)制明確的治療新策略，進(jìn)一步驗(yàn)證了線粒體靶向藥物遞送系統(tǒng)在克服腫瘤耐藥中的特別優(yōu)勢。

圖6. 耐藥乳腺癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控及其在抗癌治療中的作用。(A)每組樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)的PCA評分圖。(B)圓形圖描繪了MCF-7/DOX細(xì)胞與HDT-Z@MNs處理24小時(shí)的MCF-7細(xì)胞和對照樣品相比的脂質(zhì)亞類組成。(C)柱狀圖顯示不同能量代謝物的KEGG通路聚類。(D)差異表達(dá)的脂質(zhì)代謝物的KEGG分類。(E)說明磷酸乙醇胺差異表達(dá)的小提琴圖。(F)在HDT-Z@MNs和相關(guān)對照條件下處理MCF-7/DOX細(xì)胞時(shí)，參與線粒體介導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵蛋白的Western blot分析。采用雙因素方差分析和Sidak多重比較檢驗(yàn)評估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。(G)灰度值量化(n = 3；(H)對MCF-7/DOX細(xì)胞進(jìn)行處理后Annexin V-FITC/PI凋亡分析，并采用流式細(xì)胞術(shù)門控策略。代表性圖像來自三個(gè)獨(dú)立的生物重復(fù)（n = 3）。Q1，機(jī)械損傷死細(xì)胞；Q2，晚期凋亡細(xì)胞；Q3，對應(yīng)早期凋亡細(xì)胞；Q4，表示活細(xì)胞。采用單因素方差分析和Tukey事后檢驗(yàn)評估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。P值如圖所示。

總結(jié)：這項(xiàng)研究不僅展示了微針系統(tǒng)的高度可控性與安全性，也提出了以線粒體為新興靶點(diǎn)的多重協(xié)同治療策略，為乳腺癌及其他耐藥性實(shí)體瘤的臨床治療提供了新方向。